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胡必杰丨二代测序技术(NGS)--抗感染精准治疗中的临床实践

发布日期:2019-05-20来源: SIFIC感染科普笔记发布人:王小虾

讲者丨胡必杰(复旦大学附属中山医院)

整理丨宋慧敏

责编丨吴怀英/米宏霏

来源丨2018全国感控与耐药感染大会


编者按

在 2017年全国感控年会上,中华预防医学会医院感染控制分会主任委员、复旦大学附属中山医院胡必杰教授呼唤快速有效的病原学诊断---二代基因测序技术,直击中国感控要害。2018全国感控与耐药感染大会上胡必杰教授再次强调,感染性疾病的诊治,降低感染的病死率,改善预后的最核心问题依旧依赖于快速、准确的病原体诊断,同时分享了1年来使用微生物最新检测技术---二代基因测序技术(NGS)在抗感染精准治疗中的临床实践体会。




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一、目前抗感染治疗过程中使用抗生素常见的错误

  • 将非感染病误判为感染病,而使用抗生素;

  • 病原体种类判断错误,选择无效的抗生素;

  • 病原体耐药判断错误,选择不敏感的抗生素;

  • 经验性选药,过度追求病原体的广覆盖;

  • 微生物检验报告单解读错误;

  • 未能按照PK/PD原理,制定合适给药方案;

  • 抗感染疗程过长;

  • 成本效益分析,优化药物选择考虑不足。

 

二、国内微生物检测的现状与方向

目前临床面临的状况是病原体越来越复杂,耐药情况越来越严重,对微生物实验室的质量要求越来越高。细菌学检测技术的发展方向:

  1. MALDI-TOF:已经在很多医院开展,可以缩短细菌的鉴定时间,更是可以直接缩短微生物血培养时间;

  2. 自动化的微生物检测技术:优化流程,缩短报告时间;

  3. 基因检测技术:宏基因组测序---二代测序技术。

 

三、国际视野

2018年ECCMID年会:微生物和感染控制需要密切结合,并报道了基因的监测技术,尤其是二代测序技术在控制细菌感染中的应用。二代测序技术具有简便、快速、灵敏度高、对微生物的检测覆盖面广的优势,对微生物的追踪很有意义。二代测序技术目前影响推广最核心的问题是价格昂贵。如果技术推广、价格降低,您做好解读复杂微生物报告单的准备了吗?


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四、二代测序技术应用在上海中山医院1000多例临床实践案例分享

意料之外、情理之中——肺诺卡菌病的诊断


案例一

女62岁,反复发热咳嗽、咳痰7月,最高体温达39.5℃,多次痰培养铜绿假单胞菌;抗感染治疗后热退,停药后病情反复,发热间歇期逐渐缩短。对支气管肺泡灌洗液(BALF)行宏基因检测,提示诺卡氏菌感染。后与微生物实验室沟通延长标本培养时间,7天后报告诺卡氏菌。抗感染治疗方案改为亚胺培南+复方SMZ,10天后复查CT提示炎症明显吸收,出院改为口服复方SMZ+利奈唑胺治疗,疗程3个月,未再复发。


案例二

男65岁,反复发热、咳嗽伴痰血8年,CT显示:双肺多发斑片斑点影。先后予抗结核、抗真菌和激素治疗,病情反复。2017.10.22再次出现症状,痰涂片找抗酸杆菌2+,ESR 31mm/H;肺泡灌洗液mNGS提示诺卡菌生长(华莱士诺卡菌),痰涂片抗酸杆菌1+,。治疗1个月后门诊随访,患者咳嗽咳痰明显好转,再无发热和咳血。病人表示8年来从未感到呼吸如现在这般顺畅,复查胸部CT示,肺病灶大部分吸收,炎症标志物下降至正常:CRP 1mg/L,ESR 10mm/H。


案例三

男35岁,2017年12月初出现发热、Tmax 40℃,伴咳嗽咳痰(黄脓痰),盗汗。外院予抗感染治疗(头胞哌酮舒巴坦+左氧氟沙星、莫西沙星+奥司他韦等),症状反复无缓解,精神萎靡,纳差,2个月内体重下降14kg。2018年1月18日入中山医院。入院后诉头痛,伴恶心,肺部CT:两肺炎症伴实变、不张,头颅MR:脑内广泛多发病变,病灶周围明显水肿。常规微生物学检查均无阳性结果。脑脊液、肺组织匀浆的mNGS:提示诺卡菌感染。治疗:利奈唑胺0.6g q12h+SMZ 1.44g tid+美罗培南2g q8h。患者头疼缓解,未再发热。复查胸部CT:两肺病灶较前吸收好转,头颅MR:脑内广泛多发病变较前吸收,水肿范围缩小。针对脑部诺卡菌治疗需延长到6月。


感慨:由于常规微生物检测技术的限制,导致无法及时发现诺卡菌。这些案例说明,诺卡菌病已经不是罕见疾病了。


从基因水平提供病原学依据---大大缩短诊断时间


案例四

女23岁,学生,发现右侧颈部肿块1月。T-SPOT A/B: 35/19,临床考虑颈部淋巴结结核。传统方法始终未获取病原学依据。颈淋巴结穿刺第二天,颈淋巴结穿刺脓液mNGS提示:结核分枝杆菌感染。淋巴结清创术后第3天,颈部组织mNGS:结核分枝杆菌


案例五

男27岁,右肋腰部肿块2月,T-SPOT A/B: 69/13, 右侧腰部脓肿穿刺,较多凝固性坏死及中性粒细胞,结核坏死不能除外,抗酸(-)穿刺液涂片找抗酸杆菌(-);。右侧肋腰部脓液涂片找抗酸杆菌和分支杆菌培养各5次均为阴性;痰找抗酸杆菌的分支杆菌培养各1次,均阴性。不同部位标本mNGS提示结核分枝杆菌感染


案例六

女79岁,Tmax 38.8℃,咳嗽咳痰,发热4天。2017.9.2肺部CT提示:两肺轻度多发感染灶,怀疑结核或者真菌感染,2017.9.6肺部CT:两肺多发感染灶明显加重,支气管镜检查管腔内见较多脓性粘稠分泌物,灌洗液及咳出物:抗酸杆菌(+)。9.10肺泡灌洗液NGS结果提示:鸟分枝杆菌。9.15肺泡、肺组织分枝杆菌培养陆续报告阳性10.24微生物回报:胞内分枝杆菌。因NTM生长较慢,并有杂菌污染,多次药敏试验失败。


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案例七

男45岁,体检发现左下肺结节2月,无发热、咳嗽、咳血、乏力盗汗等。9.29CT左下肺结节1.2cm。WBC9.96,N67.4。给予头孢呋辛+阿奇霉素治疗;10.18隐球菌荚膜抗原1:80,改用氟康唑0.4 qd。11.18、11.27CT较前进展,WBC 7.86,N65.3%,,ESR32,CRP 8.0,PCT 0.19,G/GM:(-),T-SPOT61/42。提示:结核?隐球菌?氟康唑耐药?结果肺穿刺组织培养:新型隐球菌,mNGS:隐球菌属


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案例八

男56岁,左下肢红肿3周,皮肤水泡破溃1周,重症肌无力,胸腺瘤切除术后4年。2018.2.18出现左小腿外侧和左外脚踝处皮肤发红,范围逐渐增大,皮温升高,伴疼痛。3月初出现绿豆大小透明水疱。外院予哌拉西林他唑巴坦、头孢米诺治疗,红肿无好转,疼痛明显。3月11日胸部CT:右肺小结节,两肺散在少许慢性炎症及陈旧灶。3月13日左小腿皮肤红肿、右腋窝结节。3月16日小腿皮肤组织NGS:新生隐球菌。小腿皮肤活检标本真菌培养:新生隐球菌。左小腿皮肤活检病理符合真菌感染,隐球菌感染可能性大。


感悟:在隐球菌病确诊12例中NGS检出6例,检出率50%。2例肺组织匀浆,4例BAL。这些数据告诉我们,二代测序技术在检测真菌方面同样具有一定的意义。

 

二代测序技术---不同部位、不同标本中大显身手


案例九

男56岁,发热咳嗽咳痰23天。肺部CT变化见下图:



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痰培养(3-7天):烟曲霉,mNGS:(48小时):烟曲霉。给予伏立康唑静滴+两性霉素B雾化吸入+糖皮质激素抗炎。起始卡泊芬净联合治疗12天,好转出院。

 

案例十

男41岁,咳嗽咳痰20年,间断痰血5年,加重5天。2017.10.27、10.29、10.31痰标本:涂片找细菌、真菌、抗酸杆菌均为(-),培养(-)。10.27肺泡灌洗液:细菌、真菌、曲霉、分枝杆菌培养(-)。GM试验0.77ug/L,烟曲霉lgG抗体>500AU/ml,烟曲霉lgM抗体<31.25AU/ml。10.29肺泡灌洗液NGS检测:肺曲霉菌。10.31予伏立康唑0.2 q12h,症状好转,痰血停止。

 

案例十一

女53岁,反复咳嗽、咳痰4年余。



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初步考虑隐球菌感染。送检痰液mNGS结果:第二天回报曲霉菌。此病例让我们对曲霉菌感染的影像学有了不同认识。


NGS在曲霉感染中的应用情况:

怀疑曲霉菌感染患者44例,送检标本81份。

血液标本5份、呼吸道标本76份。

诊断烟曲霉感染17例(包括病理阳性)。

NGS与常规培养方法阳性率比较:NGS阳性率85.2%,真菌培养阳性率51.6%,

NGS检测的敏感性更高。

 

病例十二

医院内获得性病毒感染


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病例十三

男54岁,反复关节疼痛8年,加重伴红肿2周。血WBC 19.79,N 90.9%; ESR 78mm/H, CRP242mg/L, 12月5日局部脓肿行穿刺抽液送微生物涂片+培养及二代测序。二代测序结果:军团菌属,见下图


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案例十四

男54岁,反复咳嗽伴咳血1年,右胸壁肿物3月余。血WBC 12.54. N 77.8%。CRP 75.8mg/L, ESR 76mm/H ,PCT 0.12ng/ml。T-SPOT A/B:1/0 。痰涂片、伤口脓液找细菌、真菌、抗酸杆菌均无结果。9月15日腹盆增强CT:右侧多个胸腹壁肿物。9月22日mNGS:考虑肺部厌氧菌(具核梭杆菌、福赛斯坦纳菌和牙龈卟啉单胞菌)混合感染,继发脓胸、胸壁脓肿,给予哌拉西林/他巴唑+左奥硝唑治疗后痊愈,具体检验治疗结果见下图:


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案例十五

男51岁,右侧胸痛1周,WBC 11.78x109/L, N 83.4%,CRP204.4mg/L, ESR 78mm/H ,血培养(-),胸部CT:右下肺团片影,右侧少量胸腔积液。18年1月23日,B超引导下引流45ml棕黄色脓臭液体,微生物涂片、培养均阴性,1月25日mNGS诊断:右肺脓肿(产线菌属及具核酸杆菌感染)


案例十六

男43岁,反复咳嗽咳痰5年余。脓液培养:溶血链球菌。mNGS检测出传统难以生长的厌氧菌,诊断:左肺慢性肺脓肿(普氏菌等厌氧菌混合感染)。

 

小结

脓液标本的培养  vs  二代测序技术(NGS)

  • 二者临床符合率较高,但NGS不能提示药敏,对普通细菌优势不明显;

  • 对于临床怀疑特殊病原体,尤其是普通培养阴性或者经验性治疗效果不佳者,推荐NGS,有助于指导治疗及早期治疗。

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感悟

宏基因检测技术为感染性疾病的病原学诊断打开了一扇门,虽然它不能解决所有的病原学诊断问题,但目前的宏基因监测技术,可以解决部分疑难感染的病原学诊断,缩短感染病确诊时间,尽快目标性抗感染治疗,改善患者预后。随着基因检测技术的发展,人们对检测报告单的正确解读,我们有理由相信感染性疾病的病原学诊断和鉴别诊断会越来越好!

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